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ADP-Glo? Kinase Assay with PIP2:3PS

 
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1.含干冰类产品有运费;

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其它组分:

ADP-Glo™ Reagent【子货号:V912A,包装:1 x 5ml,,运保温度:–30°C 到 –10°C】
Kinase Detection Buffer【子货号:V913A,包装:1 x 10ml,,运保温度:–30°C 到 –10°C】
Kinase Detection Substrate【子货号:V914A,包装:1 x 1 each,,运保温度:–30°C 到 –10°C】
Ultra Pure ATP, 10mM【子货号:V915A,包装:1 x 500μl,,运保温度: –65°C】
ADP, 10mM【子货号:V916A,包装:1 x 500μl,,运保温度:–30°C 到 –10°C】
PIP2:3PS Substrate, 1mg/ml PIP2【子货号:V170A,包装:1 x 0.25ml,,运保温度: –65°C】
Lipid Dilution Buffer, 10X【子货号:V180A,包装:1 x 1ml,,运保温度:–30°C 到 –10°C】
MgCl2, 1M【子货号:V330A,包装:1 x 1ml,,运保温度:–30°C 到 –10°C】


描述:

说明

 

磷脂酰肌醇( PI ) 及 其磷酸化衍生物,统称为 磷酸肌醇( Phosphoinositides ) ,是重要的第二信使,而第二信使作为信号分子在细胞膜重构中起关键作用。它们由一类被称为磷酸肌醇脂质激酶( Phosphoinositide Lipid Kinases , PIKs )的激酶家族催化产生。在哺乳动物中,已确定 19 个 PIK 亚型。根据其对磷酸化肌醇环第 3 、 4 、 5 位羟基基团磷酸化偏好, 大致分为三个主要的家族:磷酸肌醇 3 - 激酶( PI3Ks ),磷脂酰肌醇 4- 激酶( PI4Ks )和磷酸肌醇磷酸 - 激酶( PIP5Ks 和 PIP4Ks )。

Promega 脂质激酶活性检测系统,利用 ADP-Glo Kinase Assay 激酶活性发光检测平台,提供脂质激酶、底物和 ADP-Glo 检测试剂,为脂质激酶反应提供了整套完备试剂。这些试剂包括纯化的人类 I 类 PI3Ks 重组蛋白,优化的反应缓冲液和即用型脂质激酶底物。

可单独购买酶,也可购买整套完备试剂盒 PI3K-Glo™ Class I Profiling Kit ,组分包括 PI3Ks (α、β、γ、δ,各 5 μ g ), PIP2 : 3PS 脂质激酶底物( 0.25mg )和 ADP-Glo ™激酶检测试剂盒 (1,000 次 ) 。底物以冷冻小 单层 脂质 体形式提供,为磷脂酰肌醇( PI )或磷酸肌醇 -4,5- 二磷酸( PIP2 )与载脂磷脂酰丝氨酸( PS )的混合物,两者混合比例为 1:3 。 PI 与 PS 1:3 混合优化后的底物可用于 I 类 PI3Ks 。已证实, PI 与 PS 1:3 混合后的底物可被大多数 PI3K 家族成员识别,可做为通用型 PI 脂质激酶底物。

脂质激酶活性检测原理如图 1 所示。将脂质激酶底物( 1 PI : 3 PS 或 1 PIP2 : 3 PS )、重组脂质激酶和 ATP 共同孵育进行脂质激酶反应,之后用 ADP-Glo ™激酶检测试剂盒检测激酶活性。 ADP-Glo ™激酶检测试剂盒操作分两个步骤: 1 )激酶反应后,加入 ATP 耗竭试剂终止激酶反应,同时耗尽所有剩余 ATP ,只留下 ADP ; 2 )加入激酶检测试剂,将 ADP 转变为 ATP ,同时在偶联的萤光素酶 / 萤光素反应中将 ATP 转变为光信号。

 

特点

 

•  提供 类 PI3Ks 活性检测完整解决方案:

•  纯化的人源重组酶,高度特异活性

•  即用型脂质底物( PI 或 PIP2 )

•  通用反应缓冲液

•  高灵敏度检测

•  选择性卓越: 即使 % 底物转化率很低,仍可获得高信噪比

  结果可靠: 动态范围宽、背景低、灵敏度高,减少了数据的不可靠性

•  节约时间: 均质检测,简便的 " 加样 - 读数 " 模式

•  避免假阳性结果: 特殊配方和发光检测降低了假阳性率

•  节约经费: 可轻松升级至 1,536 孔板检测模式,降低每孔检测成本

 

操作手册  

ADP-Glo™ Lipid Kinase Assay Technical Manual

 

参考文献  

•  Cantley, L.C. (2002) The phosphoinositide 3-kinase pathway. Science 296 , 1655–7.

•  Markman, B. et al. (2010) Status of PI3K inhibition and biomarker development in cancer therapeutics. Annals Oncology 21 , 683–91.

•  Brown, J.R. and Auger, K.R. (2011) Phylogenomics of phosphoinositide lipid kinases: perspectives on the evolution of second messenger signaling and drug discovery. BMC Evolutionary Biology 11 , 1–34.

•  Hawkins, P.T. et al. (2006) Signalling through Class I PI3Ks in mammalian cells.Biochem. Soc. Trans. 14 , 647–62.

 


注意事项:

PI3K 重组酶( Recombinant PI3K Enzymes ):将 PI3K 重组酶储存于 –65°C 以下。首次使用,快速融化置于冰上,根据每次实验用量将酶分装成小份,并立即冻存分装管。避免反复冻融。

脂质底物:将脂质底物储存于 –65°C 。使用前,室温融化至底物完全平衡到室温。 涡旋震荡,充分混合至少 1 分钟。 融化后的脂质底物可在室温保存至少 6 小时( 15-30 ℃),或储存在 2-10 ℃一个星期。

缓冲液:将 5X PI3K Reaction Buffer , 10X Lipid Dilution Buffer 和 1M MgCl2 储存于 –30°C 到 –10°C 。

ADP-Glo™ 检测试剂盒:收到试剂盒后,将 ATP 取出并储存于 –65°C 以下,其余组分储存于 –30°C 到 –10°C 。使用前,将所有组分在室温下彻底融化。融化后,将每种组分充分混匀。由于 ATP 反复冻融容易水解,请将其分装成小份储存于 –65°C 以下。激酶检测试剂(激酶检测缓冲液 + 底物)和 ADP- Glo™ 试剂也应分装成小份储存于 –30°C 到 –10°C 。 为方便使用,这两种试剂在室温下存放 24 小时内不会产生信号衰减。


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