FspEI

• 产品编号：R0662L      品牌：New England Biolabs       原厂货号：R0662L
• 产品分类：克隆 > 限制性内切酶和连接酶 > 限制性内切酶 > F
• 应用分类：

描述：

识别位点：

在不同反应缓冲液的活性

NEBuffer 1:NR%

NEBuffer 2:NR%

NEBuffer 3:NR%

NEBuffer 4:100%

概述

FspEI 是修饰依赖型内切酶，经过 EpiMark™ 验证，能识别 CmC 位点，其切割位点在距离带有修饰的胞嘧啶以外 3´端 N12/N16 处切割。可识别的胞嘧啶修饰包括：5-甲基胞嘧啶（5-mC）和 5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）(1)。

在真核生物中最常见的表观遗传修饰是位于 CpG 或 CHG 位点上的甲基化修饰。这一系列的修饰位点均可以被 FspEI 识别和切割。

完全甲基化的 CpG 位点：
5´…CCmGG…3´
3´…GGmCC…5´

或 CHG 位点：
5´…CmCHGG…3´
3´…GGDmCC…5´

H = A 或 C 或 T（不是 G）
D = A 或 G 或 T（不是 C）

FspEI 识别每一个半甲基化位点，分别双向切割产生 32 碱基或 31 碱基的片段。这些片段含有核心甲基化位点，并在每一个片段的 5´末端有一个 4 碱基突出。FspEI 不切割未修饰的 DNA。

来源：重组 E. coli 菌株，含有从 Frankia species EAN1pec 合成的 FspEI 基因。

贮存条件：300 mM NaCl，10 Mm Tris-HCl（pH 7.4 @ 25℃），0.1 mM EDTA，1 mM DTT，

200 μg/ml BSA 和 50%甘油。

随酶提供试剂：10X NEBuffer 4，100X BSA。
 

反应条件：1X NEBuffer 4，加入 BSA，37℃温育。
1X NEBuffer 4：50 mM KAc, 20 mM Tris-Ac, 10 mM Mg(Ac)₂, 1 mM DTT, pH 7.9 @ 25℃。

单位定义：1 单位指 50 μl 反应体系中，37℃条件下 16 小时完全消化 1 μg pBR322（dcm+）DNA 所需的酶量。

稀释兼容性：稀释液 B。
300 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，500 μg /ml BSA ，50%甘油

(pH 7.4 @ 25℃)。

质量控制检测

质量保证：EpiMark 系列产品已经广泛应用于表观遗传学研究。

基因组 DNA 酶切步骤：
1. 在无菌离心管中依次加入以下试剂（注意：FspEI 要最后加入到反应中）：
DNA（0.5-1 μg） 1-5 μl
10X NEBuffer 4 3 μl
BSA 1 μl
FspEI 0.5-1 μl（2-4 units）
灭菌双蒸水 至 30 μl 
2. 37℃温育 4-16 小时。

16 小时温育：50 μl 反应体系中，20 单位酶与 1 μg 未经修饰的底物 DNA [pBR322（dcm-）] 温育 16 小时，琼脂糖凝胶电泳未显示有非特异性核酸酶产生的 DNA 条带。

核酸外切酶活性：50 μl 反应体系中，20 单位酶与 1 μg 单双链混合 3H 标记的 E.coli DNA

（10⁵ cpm/μg）于 37℃温于 4 小时，释放小于 0.1%的放射性物质。

RNase 检测：10 μl 反应体系中，20 单位酶与 40 ng RNA 转录产物于 37℃过夜温育，琼脂糖凝胶未检测到 RNA 降解。

酶的存活性：16 小时消化 1 μg 底物 DNA 至少需 0.16 单位的酶量。

热失活：65℃ 20 分钟。

原厂资料：

注意事项：

过量使用该酶会抑制切割反应。根据不同底物，优化酶量已达到最佳酶切效果，延长温育时间降低酶量也可以达到完全酶切 DNA 的效果。FspEI 可以在37℃稳定 16 小时以上。