T4 DNA LIGASE

产品编号：EL0014 品牌：invitrogenH 原厂货号：EL0014
产品分类：克隆 > 限制性内切酶和连接酶 > 连接酶
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其它组分：

保存缓冲液组分：20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA和50% (v/v)甘油。

10X T4 DNA Ligase 缓冲液(#B69)：400 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP (pH 7.8, 25°C)。

描述：

快速 – 室温下10分钟内完成粘末端的连接反应。
该酶在Fermentas公司限制酶、PCR和RT缓冲液(添加ATP)中活性。
配套提供聚乙二醇溶液以有效进行平末端连接。

克隆酶切产生的DNA片段。
克隆PCR产物。
连接双链寡聚核苷酸街头或连接物。
定点诱变。
扩增片段长度多态性 (AFLP)。
连接酶介导的 RNA 检测 (3)。
双链DNA，RNA 或 DNA/RNA 复合体中缺口的修复。
线性 DNA自身环化。

T4� DNA Ligase催化双链DNA或RNA中毗邻的5’ -磷酸基团和3’-羟基末端之间形成磷酸二酯键。酶还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA复合体中的单链切口，连接DNA的粘性和平末端，但是该酶对单链核酸无酶活性 (1, 2)。T4 DNA Ligase需要辅因子ATP。

1 Weiss u/µl = 200 CEU*/µl
5 Weiss u/µl = 1000 CEU*/µl
30 Weiss u/µl = 6000 CEU*/µl
* 一个粘性末端连接单位的是指在16°C 、30分钟内50%连接HindIII酶切的lamda DNA产物所需要的酶的量。

1个活性单位是指在ATP-PPi交换反应中，37°C、20分钟内将1nmol [³²PPi]转换为Norit可吸收形式所需的酶量(Weiss单位**(4)。酶活性分析混合物：66 mM Tris-HCl (pH 7.6), 6.6 mM MgCl₂, 0.066 mM ATP, 10 mM DTT, 3.3�µM [³²PP_i].** 1个Weiss单位相当于约200个粘性末端连接单位。1个粘性末端连接单位：20� μl反应体系(50 mM Tris-HCl�(pH�7.5), 10 mM燤gCl₂, 10 mM燚TT, 1 mM ATP, 25 µg/ml燘SA, 0.12 µM (300�µg/ml)的5’-DNA末端)中，在16°C、30分钟内50%连接HindIII酶切的Lambda DNA产物所需要的酶量。

相关测试表明无内切和外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。功能检测：粘性末端或平末端DNA的连接能力。

抑制剂：当反应体系中NaCl或KCl的浓度超过200� mM时，可强烈抑制T4 DNA Ligase活性。失活：65°C加热10分钟或者70°C加热5分钟。

注意事项：

聚乙二醇(PEG) 极大地增加平末端连接效率 (5) 。反应体系中的PEG 4000的建议浓度为5% (w/v)。
T4 DNA Ligase与DNA结合会改变条带的琼脂糖凝胶电泳迁移率。为避免此现象，电泳前需处理样本或分子量标准。样本处理方法如下：样本或分子量标准与Fermentas公司6X DNA Loading Dye & SDS溶液(#R1151)混合；70°C加热5分钟或65°C加热10分钟后冰浴保存。
转化时，连接产物的体积不能超过感受态细胞体积的10%。
电转化之前，先用氯仿抽提方法除去连接混合物中的T4 DNA Ligase。然后经乙醇沉淀纯化抽提产物。