底物用符号S表示。底物为参与生化反应的物质，可为化学元素、分子或化合物，经酶作用可形成产物。一个生化反应的底物往往同时也是另一个化学反应的产物。

特定的底物会在特定的酶作用下，合成或分解，两者之间具有一定的专一关系。如蛋白酶(或蛋白水解酶)的底物是蛋白质；葡萄糖氧化酶的底物是葡萄糖；尿素酶的底物是尿素，尿素经酶催化产生二氧化碳和氨。

酶与底物作用机理：

1. 中间产物学说

酶在催化时，首先与其底物结合，生成酶-底物复合物，由于其结合导致分子中某些化学键发生变化，呈不稳定状态，亦即活化态，时反应活化能降低，经催化作用后再分解为酶和底物。

2. 锁钥学说

1890年费歇尔提出此假说。这一学说认为酶和底物的结合状如钥匙与锁的关系。底物分子或其一部分像钥匙一样，专一地楔入到酶的活性中心部位，即底物分子进行化学反应的部位与酶分子活性中心具有紧密互补的关系。

此学说很好地解释了酶的立体异构专一性，但不能解释酶的活性中心既适合于可逆反应的底物，又适合于产物，也不能解释酶专一性中的所有现象。

3. 诱导契合学说

酶分子活性中心的结构原来并非和底物的结构相互吻合，但酶的活性中心是柔性的而非刚性的。当底物与酶相遇时，可诱导酶活性中心的构象发生相应的变化，其上有关的各个基因达到正确的排列和定向，因而使底物和酶能完全契合。当反应结束产物从酶分子上脱落下来后，酶的活性中心又恢复成原来的构象。