原代细胞培养

原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
　

    由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养.原代培养细胞离体时间短,性状与体内相似,适用于研究。
    幼稚状态的组织和细胞,如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养

原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）
    1 、取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡.把整个孕鼠浸入盛有 75 ％乙醇的烧杯中消毒 3-5 分钟,取出后放在大平皿中携入超净台.用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤,剖腹取出子宫置于无菌平皿中.用消过毒的剪刀剪开子宫,取出鼠胎,剪去头、爪,以平衡盐溶液洗去血污
    2 、切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次,然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎,直到成 1mm3 左右的小块,再用平衡盐溶液清洗,洗到组织块发白为止.静置数分钟,使组织块自然沉淀到管底,弃去上清
    3 、消化、接种培养：加入 0.25 ％胰蛋白酶消化液（ 5-10 倍量）,与组织块混匀.置 37 ℃水浴,观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管）,静止,吸去上清,加入 5 ～ 10ml 细胞培养液,用吸管吹打混匀,移入二个培养瓶中,置于二氧化碳培养箱中培养
    细胞接种后一般几小时内就能贴壁,并开始生长,如接种的细胞密度适宜, 5 天到一周即可形成单层.

传代细胞培养原理
    体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代,以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞,并维持细胞种的延续培养的细胞形成单层汇合以后,由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭,将培养的细胞分散,从容器中取出,以 1:2 或 l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养,即为传代培养.
    细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间,与细胞世代或倍增不同.在一代中,细胞培增 3 ～ 6 次.

传代细胞培养操作
    将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中倒掉瓶内的培养液,加入少许消化液 ( 以液面盖住细胞为宜 ) ,静置 5 ～ 10 分钟,在倒置镜下观察被消化的细胞,如果细胞变圆,相互之间不再连接成片,这时应立即在超净台中将消化液倒掉,加入 3 ～ 5ml 新鲜培养液,吹打,制成细胞悬液.
    将细胞悬液吸出 2ml 左右,加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加 3ml 左右培养液,盖好瓶塞,送回二氧化碳培养箱中,继续进行培养
    一般情况,传代后的细胞在 4 小时左右就能附着在培养瓶壁上, 2 ～ 4 天就可在瓶内形成单层,需要再次进行传代

最近在分离原代肝细胞，用的是两步灌流法，就是先用灌流液，后用胶原酶灌流消化，然后用200目筛网过滤，50g离心3min，之后用PBS洗3次，也是上面的转速和时间，得到下层的肝细胞，用培养液悬浮，接到6孔板里，然后就有浑浊的沉淀，那个沉淀是肝细胞吧？4个小时之后换液，请问这个时候肝细胞是不是已经贴壁了，我看到还是要多沉淀，也不知道是死细胞还是没贴壁的细胞，请高手指点啊。。。要多长时间才换液呢？